本研究以花色模式植物圓葉牽牛(Ipomoeapurpurea)的花青素代謝途徑為主要研究對象，深入解析其調(diào)控復(fù)合物IpMYB1-IpbHLH2-IpWDR1對應(yīng)在相關(guān)靶基因啟動子上的順式元件，并在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中對部分研究結(jié)論進(jìn)行了檢驗(yàn)。隨后本研究將考察對象擴(kuò)展到其它已有部分研究數(shù)據(jù)的被子植物，包括紫玉蘭(Magnolialiliflora)、玉米(Zeamays)和非洲菊(Gerberahybrida)這些代表被子植物主要類群的物種，試圖從轉(zhuǎn)錄因子和順式調(diào)控元件兩個方面探尋花青素代謝途徑在表達(dá)調(diào)控上的特點(diǎn)及可能存在的進(jìn)化信號。

前　　言花青素（anthocyanin）是大部分被子植物花朵顏色的決定性色素，可使花朵呈現(xiàn)出粉、紅、紫、藍(lán)等一系列顏色。同時，它與葉綠素（chlorophyll）和類胡蘿卜素（carotenoid）配合，也可以使植物的果實(shí)和葉片呈現(xiàn)出五彩斑斕的著色模式。植物美麗的色彩不僅有觀賞價值，更對植物的生活有直接的作用。鮮艷的花朵和果實(shí)可以幫助植物吸引傳粉者和果實(shí)傳播者，有利于植物的繁殖。紅色的葉片則可以保護(hù)植物對抗紫外線、病蟲害以及食草動物的進(jìn)食等。對人類而言，花青素是一種天然強(qiáng)效的自由基清除劑，具有抗氧化、抗突變、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)肝臟、抑制腫瘤等多種保健功能。在心血管疾病和癌癥頻發(fā)的現(xiàn)代社會，各種富含花青素的食物品種也受到人們的青睞。花青素屬于植物的次生代謝產(chǎn)物，由一系列結(jié)構(gòu)基因編碼的酶催化合成。這一系列結(jié)構(gòu)基因構(gòu)成了花青素合成途徑，是被子植物中較為保守的一個途徑，可以被眾多的環(huán)境因素誘導(dǎo)表達(dá)。多個物種的研究表明，由MYB、bHLH和WDR三類調(diào)控因子（TFs）組成的MBW復(fù)合體調(diào)控著花青素代謝途徑上眾多結(jié)構(gòu)基因，讓它們得以協(xié)同地表達(dá)。基因的表達(dá)調(diào)控是基因功能得以實(shí)現(xiàn)的重要過程，基因間的協(xié)同表達(dá)是基因組整體功能的重要方面。關(guān)于花青素代謝途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)和調(diào)控基因的功能已有較廣泛的研究，但對于MBW復(fù)合體如何協(xié)同調(diào)控整個途徑眾多基因的表達(dá)還不太清楚。以上疑問的解決，關(guān)鍵在于結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因之間的聯(lián)結(jié)紐帶順式調(diào)控元件。深入比較花青素代謝途徑上眾多靶基因?qū)��?yīng)于MBW復(fù)合體的順式調(diào)控元件，對于人們從整體的角度了解基因組內(nèi)代謝途徑的調(diào)控具有重要的意義。本書以花色模式植物圓葉牽牛（Ipomoea purpurea）的花青素代謝途徑為主要研究對象，深入解析其MBW調(diào)控復(fù)合體在相關(guān)靶基因啟動子上對應(yīng)的順式元件，直觀展現(xiàn)了花青素代謝途徑多個基因啟動子上順式元件的排列組合，這些順式元件的分布差異直接影響了花青素代謝途徑上基因的表達(dá)水平。隨后本研究將考察對象擴(kuò)展到其他植物類群，試圖從轉(zhuǎn)錄因子和順式調(diào)控元件兩個方面探尋花青素代謝途徑在表達(dá)調(diào)控上的特點(diǎn)及可能存在的進(jìn)化信號。對于調(diào)控花青素代謝途徑的MBW復(fù)合體，研究發(fā)現(xiàn)，MYB的表達(dá)是花青素積累的關(guān)鍵：①M(fèi)BW復(fù)合體的靶基因眾多。一方面包括了復(fù)合體本身的兩個成員bHLH和WDR，另一方面也包括了途徑上的幾乎所有核心結(jié)構(gòu)基因，以及下游的部分修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)基因如3GGT等。②MYB單獨(dú)對以上靶基因具有弱激活功能，使得植物在信號誘導(dǎo)下產(chǎn)生特異的MYB后，可以反饋性地完成復(fù)合體中另兩個成員bHLH和WDR的積累。③由MYB、bHLH和WDR形成的MBW復(fù)合體對靶基因的激活能力相對于單獨(dú)MYB有大幅的提高，可以有效地開啟花青素合成、修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)。對于MBW復(fù)合體中MYB和bHLH對應(yīng)的順式元件，研究發(fā)現(xiàn)它們均有較大的變異范圍，分別總結(jié)為MRE［MYB識別序列，ANCNN（C/A）C］和BRE［bHLH識別序列，CACNN（G/T）］。這可以允許MBW復(fù)合體識別多個靶基因。此外，MRE和BRE在靶基因啟動子上的組合排列可以直接影響該靶基因的轉(zhuǎn)錄激活水平。紫玉蘭（Magnolia liliflora）、玉米（Zea mays）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、非洲菊（Gerbera hybrida）和圓葉牽牛代表了被子植物主要類群的物種。對它們MBW調(diào)控復(fù)合體成員的比較表明，花青素代謝途徑并非是普遍保守的。在被子植物內(nèi)，不論是調(diào)控因子的調(diào)節(jié)強(qiáng)度還是啟動子的反應(yīng)性都經(jīng)歷著緩慢而深刻的進(jìn)化。就代謝途徑上的各基因而言，啟動子的不同可以引起基因間表達(dá)的差異，這種差異大于調(diào)控因子分化帶來的影響；對物種間同源的結(jié)構(gòu)基因而言，轉(zhuǎn)錄因子間的分化則是基因表達(dá)強(qiáng)度變化的一個重要因素。本書在多年課題研究的基礎(chǔ)上總結(jié)撰寫而成，在撰寫過程中，得到了魯迎青研究員的悉心指導(dǎo)；肖大洲老師對本書的出版也做了不少輔助工作，在此一并表示感謝！本書引用了大量的相關(guān)文獻(xiàn)，其中大多數(shù)已在書中注明出處，但難免有所疏漏。在此，向有關(guān)作者和專家表示感謝，并對沒有注明出處的作者表示歉意。本書的出版由海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.317012）、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.31660074）、海南大學(xué)科研啟動基金（No.kyqd1840）共同資助完成，在此表示誠摯的感謝。本書對花青素代謝途徑進(jìn)行了直觀的描述，研究結(jié)果對認(rèn)識花青素代謝途徑的調(diào)控具有良好的促進(jìn)作用。對植物花色、葉色和果色感興趣的植物愛好者、觀賞植物的育種工作者以及研究基因調(diào)控的科研工作者，本書可作為參考書籍。盡管本書在撰寫過程中力求邏輯嚴(yán)謹(jǐn)，內(nèi)容充實(shí)，但由于著者水平有限，難免有所疏漏，懇請各位專家、同仁和廣大的讀者批評指正，以便今后完善。著　者2018年10月于海南大學(xué)

祝志欣，女，1986年4月出生，湖北武漢市人，植物學(xué)博士，現(xiàn)任海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院講師。2015年7月畢業(yè)于中科院植物研究所，獲植物學(xué)博士學(xué)位。2015年9月至今在海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院從事教學(xué)和科研工作。教學(xué)課程主要為《生物化學(xué)》、《植物生理學(xué)》、《植物生理生化》的理論及實(shí)驗(yàn)�？蒲蟹矫嬉恢睆氖轮参锘ㄇ嗨丶邦慄S酮代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控研究，研究物種主要為圓葉牽牛和甘薯。目前主持國家自然科學(xué)基金1項(xiàng)，負(fù)責(zé)海南省自然科學(xué)基金1項(xiàng)，以第一或通訊作者發(fā)表多篇論文，分別刊于JournalofExperimentalBotany，PlantMethods、植物學(xué)報(bào)、南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)、熱帶作物學(xué)報(bào)等。

1 緒 論 …………………………………………………………………1
1.1 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 …………………………………………………1
1.2 花青素代謝途徑及其調(diào)控 ………………………………………11
1.3 花青素代謝途徑改變導(dǎo)致的顏色變異 …………………………22
1.4 花青素途徑調(diào)控研究中存在的問題和本研究的目的 …………27
2 圓葉牽牛花青素代謝途徑基因啟動子克隆及序列分析 ……29
2.1 引 言 ……………………………………………………………29
2.2 材料和方法 ………………………………………………………29
2.3 結(jié) 果 ……………………………………………………………34
2.4 討 論 ……………………………………………………………44
3 圓葉牽�；ㄇ嗨卮�謝途徑MBW調(diào)控復(fù)合體的功能研究
及其靶基因的確定 …………………………………………………46
3.1 引 言 ……………………………………………………………46
3.2 材料和方法 ………………………………………………………47
3.3 結(jié) 果 ……………………………………………………………56
3.4 討 論 ……………………………………………………………61
4 圓葉牽�；ㄇ嗨卮�謝途徑基因啟動子MBW復(fù)合體
相關(guān)順式元件的解析 ………………………………………………64
4.1 引 言 ……………………………………………………………64
4.2 材料和方法 ………………………………………………………64
4.3 結(jié) 果 ……………………………………………………………68
4.4 討 論 ……………………………………………………………87
5 被子植物MBW復(fù)合體的進(jìn)化初探 ………………………………90
5.1 引 言 ……………………………………………………………90
5.2 材料和方法 ………………………………………………………92
5.3 結(jié) 果 ……………………………………………………………96
5.4 討 論 ……………………………………………………………102
6 結(jié)論與展望 ……………………………………………………………105
6.1 結(jié) 論 ……………………………………………………………105
6.2 展 望 ……………………………………………………………108
附 錄 ………………………………………………………………………110
參考文獻(xiàn) ……………………………………………………………………121