前言
白細胞介素18(Interleukine-18,IL-18)是一種多效細胞因子，具有強烈的IFN-誘生能力，對機體起著重要的免疫調節(jié)和保護作用，在抗微生物感染、抗腫瘤免疫中具有應用潛力，因此IL-18可作為免疫佐劑與一些病原微生物的保護性基因共表達，從而加強疫苗的免疫效果或制備基因工程疫苗；由于雞IL-18(ChIL-18)基因發(fā)現較晚，而對人和哺乳動物IL-18的研究已有許多報道，且其具有與人和哺乳動物相似的生物學功能，因此ChIL-18在比較免疫學研究和禽病治療中具有重要意義。pFastBacTM Dual載體含有PH啟動子和p10啟動子，可以同時表達兩個具有獨立活性的外源蛋白。桿狀病毒對脊椎動物無病原性，也不能在脊椎動物細胞內復制、表達，更不能把其基因整合到脊椎動物細胞染色體內，因此重組桿狀病毒可以被認為遺傳學上安全的表達載體。外源基因因插入多角體蛋白基因的座位引起后者的缺失或滅活，因此重組病毒不產生包涵體，這不僅為重組病毒選擇提供了標記，而且重組不能像野生型病毒那樣在環(huán)境中長期存在，所以更安全。故本研究直接將未純化的雙表達蛋白進行免疫原性研究。
傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由IBD 病毒(IBDV)感染雛雞引起的以淋巴組織，特別是中樞免疫器官法氏囊為主要特征的高度接觸性傳染病。該病主要導致機體免疫抑制，使機體的免疫能力降低和疫苗免疫接種失敗。雖然滅活疫苗和減毒活疫苗是相當成熟的，但由于IBDV強毒株和抗原變異的出現使其免疫效價降低。VP2 是IBDV的主要保護性抗原，已經鑒定的IBDV中和表位主要在VP2 上，并且多為構象依賴性，這意味著VP2 的立體結構對其中和表位的形成至關重要，與病毒中和抗體的誘導、抗原和毒力的變異以及細胞凋亡的誘導等有關。
禽流感(Avian influenza,AI)是由AI病毒(AIV)感染引起的一種高度接觸性人畜共患傳染病。HPAI 的暴發(fā)給養(yǎng)禽業(yè)帶來了一定的經濟損失，H5N1亞型AI的出現不僅產生經濟損失，還帶來了恐慌。AIV的主要抗原決定簇都位于HA1區(qū)域。體外表達HA1涵蓋了所有的HA空間中和表位，故其完全可以替代HA作為抗原。所以HA1蛋白是研制基因工程亞單位苗的理想候選抗原。
本試驗利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，選用pFastBacTM Dual雙表達載體，在昆蟲細胞中共表達mChIL-18基因蛋白和IBDV VP2基因蛋白或H5型AIV HA1基因蛋白，并對未純化蛋白生物學活性進行分析；進而研究未純化蛋白免疫原性。為進一步研究VP2基因工程疫苗、HA1基因工程疫苗的免疫效果以及mChIL-18在IBD、AI的免疫調節(jié)作用等相關研究奠定基礎。
一、ChIL-18原核表達蛋白復性研究
研究利用不同的復性方法輔助rChIL-18原核表達蛋白的復性，以提高雞IL-18重組蛋白復性率，獲得更多具有良好活性的蛋白。將重組原核表達質粒pGEX-mChIL-18轉化宿主細胞大腸桿菌BL21（DE3），并用IPTG于37℃誘導培養(yǎng)獲得表達。表達產物主要以包涵體的形式存在。包涵體經超聲波破碎、洗滌后以6mol/L的鹽酸胍溶解，使蛋白徹底變性,然后利用鹽酸胍-去離子水透析法、鹽酸胍-谷胱甘肽變性復性法和人工分子伴侶系統(tǒng)法分別輔助蛋白復性。復性產物經透析純化后，利用淋巴細胞增殖試驗來檢測其活性。經SDS-PAGE分析表明,表達產物是與ChIL-18重組蛋白相符的Mr約44000的蛋白條帶。利用人工分子伴侶系統(tǒng)輔助復性的方法獲得的復性率最高，復性率為42��54％。雞淋巴細胞增殖試驗表明,表達產物對雞淋巴細胞具有明顯誘導增殖作用。上述試驗顯示，人工分子伴侶系統(tǒng)能夠較好地輔助雞IL-18重組蛋白復性，獲得較高的復性率。其產物具有良好的生物學活性,為下一步雞IL-18重組蛋白的應用研究奠定了試驗基礎。
將重組原核表達質粒pGEX-mChIL-18轉化宿主細胞大腸桿菌BL21（DE3），并用IPTG于37℃誘導培養(yǎng)獲得表達。表達的包涵體經超聲波破碎、洗滌后以6mol/L的鹽酸胍溶解，使蛋白徹底變性。然后按照試驗設計，考察不同濃度組成的人工分子伴侶體系對不同濃度雞IL-18重組蛋白復性率的影響。試驗結果表明，利用人工分子伴侶系統(tǒng)輔助雞IL-18重組蛋白的復性存在最佳的條件，優(yōu)化該條件能夠提高該融合蛋白的復性率，且產物都具有良好的生物學活性，為雞IL-18重組蛋白的進一步應用研究奠定了試驗基礎。
二、雞IL-18原核表達蛋白及真核表達質粒對IBDV滅活疫苗免疫增強作用的研究本研究室在2001年開展雞白細胞介素18（ChIL-18）的研究，先后構建ChIL-18的重組質粒和原核表達系統(tǒng)、真核質粒及其表達系統(tǒng)，在此基礎上，對純化后的原核表達的重組雞白細胞介素18產物進行生物學活性檢測，對其在生產中的應用做了初步研究，同時對影響ChIL-18原核表達產物生物學活性的因素也進行了探討。將雞IL-18原核表達蛋白的復性產物和真核表達質粒pcDNA3��1TOPO-mChlL18分別與IBDV滅活疫苗聯合應用，通過中和抗體檢測和T淋巴細胞對ConA增殖反應試驗，研究其對IBDV滅活疫苗的免疫增強作用。結果顯示，在接種后第21、28、35及42天時蛋白組和質粒組與單純疫苗組抗體水平差異顯著（P<0��05）,且蛋白組比質粒組效果更明顯一些；其T淋巴細胞的增殖反應也強于單純疫苗組，尤其是在免疫14天后增殖效果明顯高于單純疫苗組（P<0��05）。接種42d后進行攻毒保護性試驗，結果表明：同時接種雞IL-18原核表達蛋白復性產物和真核表達質粒的試驗組雞獲得93��3％的保護率，而單純疫苗接種組的保護率為73��3％。雞IL-18的原核表達蛋白和真核表達質粒均具有明顯的增強IBD滅活疫苗免疫效果的作用。
三、mChIL-18與VP2或HA1在桿狀病毒表達載體中的共表達
分別以pMD18-T-VP2、pMD18-T-HA1和pMD18-T-mChIL18質粒為模板，以桿狀病毒pFastBacTM Dual為載體，將mChIL18基因與VP2基因或HA1基因分別插入到載體的PH啟動子和P10啟動子的下游，構建重組轉移載體質粒pF-IL18、pF-VP2、pF-IL18-VP2、pF-HA1、pF-IL18-HA1。將其轉化DH10Bac感受態(tài)細胞，經三重抗性(含卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素)與藍白斑篩選，用小量法提取重組桿狀病毒質粒rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1，通過一對通用引物M13(Bacmid含有該引物Forward和Reverse兩個引物位點，能夠從兩側擴增LacZ互補區(qū)域內的mini-attTn7位點，有利于PCR分析)進行PCR擴增鑒定。在轉染試劑Cellfectin II的作用下，通過脂質體介導法將純化的rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1轉染至草地貪夜蛾細胞(Spodoptera frugiperda 9，sf9)獲得P1代重組桿狀病毒，用P1代病毒感染sf9來擴增病毒滴度，將達到一定滴度(107～108pfu/mL)的P3代重組桿狀病毒感染sf9，感染72h后收獲sf9細胞及培養(yǎng)上清，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測和間接免疫熒光試驗(IFA)檢測。SDS-PAGE檢測顯示，mChIL-18、VP2、HA1基因均在sf9中的裂解上清中得到了高效表達，即表達的蛋白是可溶性的，表達的目的條帶分子量分別約為19��5 KD,48��4 KD,37��4 KD。IFA檢測顯示mChIL18基因與VP2基因或HA1基因分別同時在同一細胞中獨立表達。
四、雙表達產物pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的生物學活性檢測
采用雞脾淋巴細胞增殖試驗(MTT法)、IFN-誘導實驗和水皰性口炎病毒(VSV)抑制試驗對表達的蛋白進行生物學活性測定。雞脾淋巴細胞增殖試驗表明，不同濃度的pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18均能夠明顯促進淋巴細胞的增殖，隨著蛋白濃度的增加刺激轉化作用逐漸增強，均當濃度為200ng/mL時，刺激轉化效果最佳，增殖指數可達4��13、4��35、4��09，但隨著蛋白濃度的增大淋巴細胞的增殖指數逐漸降低。VSV病毒活性抑制試驗表明，當蛋白濃度大于100ng/mL時能刺激脾淋巴細胞產生IFN-，并且隨著pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18濃度的增加誘導產生IFN-的量隨之增加；將不同稀釋度的IFN-分別作用于VSV，在IFN-1102U/mL時，具有較強的抑制效果，當IFN-為10 U/mL時，只能達到約50%的保護。該結果說明pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18的抗病毒活性是通過IFN-實現的，且在一定濃度范圍內具有抑制VSV病毒產生細胞病變的作用。
五、雙表達蛋白pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的免疫原性研究將含有pIL18、pVP2、pVP2-IL18的油乳劑疫苗分組免疫動物，14d時一免，28d時二免。Ⅰ組為傳統(tǒng)疫苗組；Ⅱ組為pIL18與B78減毒疫苗聯合疫苗組；Ⅲ為pIL18與pVP2聯合疫苗組；Ⅳ組為pVP2-IL18單獨免疫組；Ⅴ組一免注射B78減毒疫苗，二免注射pVP2-IL18；Ⅵ組為pVP2單獨免疫組；Ⅶ組為對照組。從體液免疫和細胞免疫水平上分析試驗結果。細胞免疫水平通過流式細胞術檢測，從統(tǒng)計學意義上分析處理數據。結果表明，與免疫前和陰性對照組相比，各試驗組都促進CD4 和CD8 T細胞增殖。一免后各試驗組CD4 T細胞都呈上升趨勢，但一免7d后又呈下降趨勢；二免后Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ呈上升趨勢且持續(xù)時間比較長，其中Ⅳ組CD4 T增殖水平最高，在一免后21d、28d、35d都與其他組差異顯著(P<0��05)。一免后各試驗組CD8 T細胞都呈上升趨勢，但一免7d后又呈下降趨勢；二免后各實驗組仍呈不同下降趨勢，其中Ⅰ組CD8 T增殖水平最高，在一免后14d、21d、28d都與其他組差異顯著(P<0��05)。體液免疫水平通過使用傳染性法氏囊病病毒抗體檢測試劑盒檢測，從統(tǒng)計學意義上分析處理數據。結果表明，與免疫前相比，各試驗組都有較好的促進IBD抗體生成作用，抗體水平都持續(xù)增高且維持時間也較長，都在在一免后28d抗體水平達到最高；與陰性對照組相比，Ⅳ組效果最好，抗體效價最高，Ⅴ組次之,然后是Ⅱ組、Ⅰ組、Ⅲ組、Ⅵ組。攻毒試驗結果表明，Ⅳ組保護率可達90%，Ⅴ組次之可達80%，然后是Ⅰ組和Ⅱ組75%、Ⅲ組為70%、Ⅵ組50%，Ⅶ組無一幸免。
將含有pIL18、pHA1、pHA1-IL18的油乳劑疫苗分組免疫動物，7d時一免，21d時二免。Ⅰ組為傳統(tǒng)疫苗組；Ⅱ組為pIL18與傳統(tǒng)疫苗聯合疫苗組；Ⅲ為pHA1單獨免疫組；Ⅳ組為pHA1-IL18單獨免疫組；Ⅴ組pIL18與pHA1聯合疫苗組；Ⅵ組為pHA1單獨免疫組；Ⅶ組為對照組。從體液免疫和細胞免疫水平上分析試驗結果。細胞免疫水平通過流式細胞術檢測。結果表明，與免疫前和陰性對照組相比，各試驗組都能夠明顯促進CD4 和CD8 T細胞的增殖反應：一免后各試驗組CD4 和CD8 T細胞都呈上升趨勢，但一免7d后又呈下降趨勢；二免后雖呈上升趨勢且持續(xù)時間比較長，但增殖幅度不大，以Ⅳ組CD4 T增殖水平最高。體液免疫水平通過使用血凝抑制試驗檢測。結果表明，各試驗組都有較好的促進ND、H5型AI和H9型AI抗體生成作用，都是在一免后28d抗體水平達到最高；與陰性對照組相比，Ⅳ組效果最好，抗體效價最高與其他組差異顯著(P<0��05)。


著者2019年3月