前言
蘋(píng)果炭疽菌葉枯病(Glomerella Leaf Spot，GLS)是中國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)新出現(xiàn)的一種為害嚴(yán)重的流行性病害，主要為害蘋(píng)果葉片，造成病葉早期干枯、脫落，也侵染果實(shí)引起壞死性斑點(diǎn)。該病不僅導(dǎo)致當(dāng)季果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，而且大大削弱了翌年的樹(shù)勢(shì)，嚴(yán)重的威脅著蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，對(duì)蘋(píng)果炭疽菌葉枯病的防治仍以化學(xué)防治為主，但成效甚微。培育和種植抗病性強(qiáng)的優(yōu)良品種是控制該病最為經(jīng)濟(jì)、安全、有效的措施。
隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)逐漸成為植物抗病育種的有效手段。本書(shū)作者首先利用人工離體接種鑒定的方法，評(píng)價(jià)了蘋(píng)果對(duì)炭疽菌葉枯病的抗性遺傳規(guī)律，之后篩選出與蘋(píng)果炭疽菌葉枯病抗性基因位點(diǎn)（Rgls）緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記，然后通過(guò)全基因組重測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了與蘋(píng)果抗炭疽菌葉枯病相關(guān)的SNP及Indel標(biāo)記，結(jié)合SSR標(biāo)記定位的結(jié)果，進(jìn)行了SNP及Indel標(biāo)記的驗(yàn)證，完成了對(duì)Rgls基因位點(diǎn)的精細(xì)定位，最后利用篩選出的四個(gè)與Rgls基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記在蘋(píng)果栽培品種及品系中驗(yàn)證了標(biāo)記的可靠性。
一是抗性遺傳規(guī)律評(píng)價(jià)。利用2個(gè)對(duì)蘋(píng)果炭疽菌葉枯病高抗品種（系）富士QF-2和兩個(gè)高感品種金冠嘎拉為親本配制了4個(gè)雜交群體(富士金冠金冠富士嘎拉 富士富士QF-2)。以雜交群體F1植株為試驗(yàn)材料，對(duì)蘋(píng)果炭疽菌葉枯病的抗性進(jìn)行了鑒定評(píng)價(jià)和遺傳分析。結(jié)果表明，4個(gè)雜交群體中抗、感植株的分離比分別符合1��1、1��1、0��1和1��0的理論比值，初步推測(cè)蘋(píng)果抗炭疽菌葉枯病性狀受隱性單基因控制，抗病基因型為rr，感病基因型為RR和Rr。
二是SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及抗性基因位點(diǎn)Rgls的遺傳定位。利用207株金冠富士的雜交后代為試材，采用分離群體分組分析（BSA）方法，構(gòu)建SSR標(biāo)記與抗性基因位點(diǎn)Rgls連鎖圖譜。通過(guò)對(duì)300對(duì)均勻覆蓋蘋(píng)果染色體組的已發(fā)表的SSR引物在親本及抗感池中進(jìn)行初步篩選，將產(chǎn)生多態(tài)性條帶的引物進(jìn)行群體驗(yàn)證，獲得了兩個(gè)與抗病性狀相關(guān)的分子標(biāo)記CH01d08和CH05g05，這兩個(gè)標(biāo)記位于抗性基因位點(diǎn)Rgls兩側(cè)，將其定位于15條染色體上。重組率分別為7��3%和 23��2%。依據(jù)蘋(píng)果基因組CH01d08和CH05g05標(biāo)記之間的序列，自行設(shè)計(jì)了276對(duì)SSR引物。最終篩選出9對(duì)與Rgls基因位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記。這11個(gè)標(biāo)記的遺傳距離從0��5 cM 到33��8 cM，覆蓋了49��2 cM的遺傳距離，最近的標(biāo)記為S0405127遺傳距離為0��5 cM。Rgls基因位點(diǎn)兩側(cè)最近的兩個(gè)標(biāo)記S0304673和S0405127之間的物理距離為500kb。
三是SNP標(biāo)記和Indel標(biāo)記的開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證Rgls基因位點(diǎn)的精細(xì)定位�；�于全基因組重測(cè)序技術(shù)共開(kāi)發(fā)SNP位點(diǎn)3 399 950個(gè)，InDel位點(diǎn)573 040個(gè)。通過(guò)對(duì)△(SNP-index)的篩選，在全基因組范圍內(nèi)共得到33個(gè)候選的SNP位點(diǎn)及所對(duì)應(yīng)的29個(gè)候選基因。通過(guò)與SSR標(biāo)記定位結(jié)果相結(jié)合最終鎖定18個(gè)SNP位點(diǎn)、30個(gè)InDel位點(diǎn)，以及5個(gè)候選基因。通過(guò)高分辨熔解曲線(xiàn)（HRM）分析技術(shù)對(duì)SNP及InDel標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。獲得了6個(gè)SNP 及5個(gè)InDel標(biāo)記與Rgls基因位點(diǎn)緊密連鎖。通過(guò)對(duì)這11個(gè)標(biāo)記重組個(gè)體的分析，將Rgls基因所在位點(diǎn)的范圍縮小為58kb。
四是5個(gè)抗病候選基因的鑒定。通過(guò)對(duì)5個(gè)候選基因MDP0000686092、MDP0000205432、MDP0000120033、MDP0000864010、MDP0000945764的生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)經(jīng)過(guò)炭疽葉枯病病原菌侵染后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的7個(gè)時(shí)間段內(nèi)，葉片中5個(gè)候選基因表達(dá)量變化進(jìn)行分析。結(jié)果表明，5個(gè)候選基因均不同程度的響應(yīng)炭疽葉枯病病菌的誘導(dǎo)，是蘋(píng)果炭疽葉枯病的抗病相關(guān)基因。
五是分子標(biāo)記可靠性驗(yàn)證。利用4個(gè)緊密連鎖的分子標(biāo)記S0405127、S0304673、SNP4236和InDel4254對(duì)50個(gè)田間栽培品種和青島農(nóng)業(yè)大學(xué)選育出的優(yōu)系進(jìn)行了抗炭疽菌葉枯病的基因型鑒定，并結(jié)合其抗病的表型鑒定對(duì)4個(gè)標(biāo)記的準(zhǔn)確性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明4個(gè)標(biāo)記的準(zhǔn)確率分別為90��0%、94��0%、98��0%和96��0%，可以有效的應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種。通過(guò)苗期對(duì)炭疽菌葉枯病抗性的選擇，可以顯著的減少成本，縮短抗病育種周期，加快抗病育種進(jìn)程。

著者2019年4月