1 緒論............................................................................................................................. 1 1.1抗菌藥物............................................................................................................. 1 1.1.1抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)史..................................................................................... 1 1.1.2抗菌藥物的類型與作用機制....................................................................... 3 1.1.2.1β-內(nèi)酰胺類....................................................................................... 3 1.1.2.2碳青霉烯類...................................................................................... 3 1.1.2.3大環(huán)內(nèi)酯類...................................................................................... 4 1.1.2.4多粘菌素類...................................................................................... 4 1.1.2.5喹諾酮類......................................................................................... 4 1.1.2.6氨基糖苷類...................................................................................... 5 1.1.2.7其他類抗菌藥物............................................................................... 5 1.2細菌耐藥的產(chǎn)生及播散的機制............................................................................. 5 1.2.1細菌耐藥的機制......................................................................................... 6 1.2.2多藥耐藥菌的播散機制.............................................................................. 8 1.3大腸桿菌及其耐藥機制...................................................................................... 13 1.3.1大腸埃希氏菌的形態(tài)................................................................................ 13 1.3.2大腸埃希氏菌培養(yǎng)特性............................................................................ 13 1.3.3大腸埃希氏菌生化特點............................................................................ 13 1.3.4大腸埃希氏菌抗原特征............................................................................ 14 1.3.5大腸埃希氏菌的耐藥機制......................................................................... 14 1.4噬菌體及其應(yīng)用................................................................................................ 16 1.4.1噬菌體的發(fā)現(xiàn)史....................................................................................... 16 1.4.2噬菌體的形態(tài)與分類................................................................................ 17 1.4.3噬菌體的基因組學(xué)................................................................................... 18 1.4.4噬菌體的應(yīng)用.......................................................................................... 19 1.5測序技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀及應(yīng)用............................................................................... 21 1.5.1測序技術(shù)發(fā)展歷程................................................................................... 21 1.5.1.1第一代測序技術(shù)............................................................................. 22 1.5.1.2第二代測序技術(shù)............................................................................. 23 1.5.1.3第三代測序技術(shù)............................................................................. 23 1.5.1.4病毒宏基因組測序技術(shù)................................................................... 24 1.5.2測序技術(shù)的應(yīng)用....................................................................................... 25 1.6生物信息學(xué)分析................................................................................................ 25 2 肉品中的大腸埃希菌耐藥株的生物學(xué)性狀分析............................................................. 28 2.1材料與儀器....................................................................................................... 29 2.1.1材料........................................................................................................ 29 2.1.2主要儀器................................................................................................. 29 2.2方法.................................................................................................................. 29 2.2.1耐藥菌株的分離與鑒定............................................................................ 29 2.2.2紙片擴散法測定藥物敏感性..................................................................... 30 2.2.3耐藥基因篩查.......................................................................................... 31 2.2.4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移.......................................................................................... 35 2.3結(jié)果.................................................................................................................. 35 2.3.1菌株的鑒定.............................................................................................. 35 2.3.2三個分離株的耐藥譜鑒定......................................................................... 36 2.3.3三株菌耐藥基因篩查................................................................................ 36 2.3.4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移.......................................................................................... 37 2.4討論.................................................................................................................. 39 3 耐藥株質(zhì)�；�因組序列測定及其生物信息學(xué)分析......................................................... 40 3.1材料.................................................................................................................. 40 3.2方法.................................................................................................................. 40 3.2.1提取高純度的細菌基因組DNA................................................................ 40 3.2.2大片段文庫構(gòu)建....................................................................................... 40 3.2.3De Bruijn圖的基因拼接............................................................................ 41 3.3結(jié)果.................................................................................................................. 41 3.4討論.................................................................................................................. 44 4 噬菌體ΦSPHJ965的生物學(xué)特性分析及應(yīng)用................................................................ 45 4.1材料與儀器....................................................................................................... 46 4.1.1材料........................................................................................................ 46 4.1.2主要儀器................................................................................................. 46 4.2方法.................................................................................................................. 46 4.2.1菌懸液的制備.......................................................................................... 46 4.2.2噬菌體的分離純化................................................................................... 46 4.2.3噬菌體的大量增殖................................................................................... 47 4.2.4噬菌體效價測定....................................................................................... 47 4.2.5噬菌體熱穩(wěn)定性的測定............................................................................ 47 4.2.6噬菌體pH穩(wěn)定性的測定.......................................................................... 47 4.2.7噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）的測定........................................................ 47 4.2.8噬菌體一步生長曲線的測定..................................................................... 47 4.2.9噬菌體對紫外線和氯仿敏感性的測定....................................................... 47 4.2.10噬菌體體外清除試驗.............................................................................. 48 4.2.11噬菌體處理生活污水中的大腸埃希氏菌.................................................. 48 4.3結(jié)果.................................................................................................................. 48 4.3.1噬菌體的增殖和效價測定......................................................................... 48 4.3.2噬菌體熱穩(wěn)定性的測定............................................................................ 48 4.3.3噬菌體pH穩(wěn)定性的測定.......................................................................... 49 4.3.4噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測定..................................................................... 49 4.3.5噬菌體一步生長曲線的測定..................................................................... 49 4.3.6噬菌體對紫外線和氯仿敏感性的測定....................................................... 50 4.3.7噬菌體體外清除試驗................................................................................ 51 4.3.8噬菌體處理生活污水中的大腸埃希氏菌.................................................... 51 4.4討論.................................................................................................................. 51 5 水產(chǎn)品中的大腸埃希菌耐藥株分離鑒定及耐藥性狀分析............................................... 54 5.1材料與儀器....................................................................................................... 54 5.1.1菌株來源................................................................................................. 54 5.1.2試劑與培養(yǎng)基.......................................................................................... 54 5.1.3儀器與設(shè)備.............................................................................................. 55 5.2方法.................................................................................................................. 55 5.2.1耐藥菌株的分離....................................................................................... 55 5.2.2耐藥菌株的鑒定....................................................................................... 55 5.2.3耐藥譜篩查.............................................................................................. 56 5.2.4最小抑菌濃度測定................................................................................... 57 5.2.5耐藥基因篩查.......................................................................................... 59 5.2.6質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移.......................................................................................... 59 5.3結(jié)果.................................................................................................................. 59 5.3.1耐藥菌株分離與鑒定................................................................................ 59 5.3.2耐藥譜篩查.............................................................................................. 60 5.3.3最小抑菌濃度測定................................................................................... 60 5.3.4耐藥基因篩查.......................................................................................... 63 5.3.5質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移.......................................................................................... 63 5.4討論.................................................................................................................. 65 6 水產(chǎn)品耐藥菌質(zhì)粒基因組序列測定及其生物信息學(xué)分析............................................... 67 6.1材料.................................................................................................................. 67 6.2方法.................................................................................................................. 67 6.2.1提取高純度的細菌基因組DNA................................................................ 67 6.2.2大片段文庫構(gòu)建....................................................................................... 67 6.2.3質(zhì)粒測序、拼接及組裝............................................................................ 68 6.2.4質(zhì)�；�因組生物信息學(xué)分析..................................................................... 68 6.3結(jié)果.................................................................................................................. 68 6.3.1質(zhì)粒全序圖.............................................................................................. 68 6.3.2線性對比圖.............................................................................................. 69 6.3.3耐藥基因座位對比圖................................................................................ 69 6.4討論.................................................................................................................. 71 7 大腸埃希菌噬菌體的分離純化及生物學(xué)特征................................................................ 72 7.1材料與儀器....................................................................................................... 72 7.1.1菌株來源................................................................................................. 72 7.1.2試劑與培養(yǎng)基.......................................................................................... 72 7.1.3儀器與設(shè)備.............................................................................................. 72 7.2方法.................................................................................................................. 73 7.2.1噬菌體的分離純化................................................................................... 73 7.2.2噬菌體效價測定....................................................................................... 73 7.2.3噬菌體常規(guī)稀釋度的測定......................................................................... 74 7.2.4噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測定..................................................................... 74 7.2.5噬菌體吸附率的測定................................................................................ 74 7.2.6噬菌體的一步生長曲線............................................................................ 74 7.2.7噬菌體的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性............................................................... 75 7.2.8噬菌體氯仿和紫外線的敏感性測定........................................................... 75 7.2.9噬菌體的體外抑菌實驗............................................................................ 75 7.2.10噬菌體對大腸埃希菌生物膜的抑制......................................................... 75 7.2.11數(shù)據(jù)處理................................................................................................ 76 7.3結(jié)果.................................................................................................................. 76 7.3.1噬菌體的分離純化................................................................................... 76 7.3.2噬菌體效價測定....................................................................................... 76 7.3.3噬菌體常規(guī)稀釋度的測定......................................................................... 76 7.3.4噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測定..................................................................... 76 7.3.5噬菌體吸附率的測定................................................................................ 77 7.3.6噬菌體的一步生長曲線............................................................................ 78 7.3.7噬菌體的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性............................................................... 78 7.3.8噬菌體氯仿和紫外線的敏感性測定........................................................... 79 7.3.9噬菌體的體外抑菌實驗............................................................................ 80 7.3.10噬菌體對大腸埃希菌生物膜的抑制......................................................... 81 7.4討論.................................................................................................................. 81 參考文獻........................................................................................................................ 84