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郭江峰編著的《基因工程(生物工程專業(yè)綜合素質培養(yǎng)型系列教材)》系統(tǒng)介紹了基因工程的原理、策略、技術方法和應用等方面的內容，具有較強的前瞻性和實用性。全書分為基因工程基礎、基因工程操作方法和基因工程應用技術3篇，共13章，內容包括基因工程的概況、核酸操作技術、工具酶、載體與宿主系統(tǒng)、DNA 的克隆策略、聚合酶鏈反應、DNA序列分析、重組子的篩選、目的基因在受體細胞中的表達、目的蛋白的純化與分析、基因操作技術在醫(yī)學與法醫(yī)學上的應用、轉基因生物和基因工程的安全性與發(fā)展前景。《基因工程(生物工程專業(yè)綜合素質培養(yǎng)型系列教材)》可作為高等院校生物科學、生物技術、生物工程、生物制藥等相關專業(yè)本科生的教學用書，也可供相關的科研、技術和管理人員參考。

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第一篇基因工程基礎
第一章基因工程概況
第一節(jié) 基因與基因工程
一、基因的概念
1.基因概念的提出與發(fā)展
基因概念的提出已有100 多年的歷史，在這期間我們逐漸認識、深化了這個概念。
遺傳學奠基人Mendel 于1865 年2 月在奧地利自然科學學會會議上報告了自己植物雜交試驗的研究結果，次年在該學會期刊上發(fā)表了著名的《植物雜交試驗》的論文。文中指出，生物的每一個性狀都是通過遺傳因子來傳遞的，遺傳因子是獨立的遺傳單位。這樣就把可觀察的遺傳性狀和控制其內在的遺傳因子區(qū)分開來，遺傳因子作為基因的雛形名詞誕生了。
1909 年，丹麥遺傳學家Johansen 首先提出“基因（gene）” 的概念，它不包含特殊的物質基礎，只是用來描述傳遞和表達特定的生物性狀的可遺傳因子，以此替代孟德爾假定的“遺傳因子” 。
1911 年， Morgan 指出基因定位于染色體上，建立了著名的基因學說，還繪制了果蠅的基因位置圖，首次完成當時最新的基因概念的描述，即基因以直線形式排列，它決定著某一特定的性狀，而且能發(fā)生突變，并隨著染色體同源節(jié)段的互換而交換。它不僅是決定性狀的功能單位，而且是一個突變單位和交換單位。
20 世紀40 年代末至50 年代初，基因的化學本質被證實。1944 年， Avery 及其同事MacLeod 和McCarty 在肺炎鏈球菌轉化研究中，首次通過實驗證實DNA 是遺傳信息的載體。1952 年， Hershey 和Chase 用放射性同位素標記噬菌體注入細菌細胞的實驗，進一步證明遺傳物質是DNA 而不是蛋白質。
1953 年，美國分子生物學家Watson 和英國分子生物學家Crick 根據X 射線衍射分析，提出了DNA 雙螺旋結構模型，進一步說明基因的成分就是DNA ，它控制著蛋白質合成。在基因位于染色體上，并且能用重組方法作圖定位的概念建立后，人們逐漸認識到單個基因是遺傳信息結構和功能的基本且不可分割的單位；從結構和功能來看，它們以線性的形式相互連接（串珠理論， the beads on a string theory）。
1957 年，法國遺傳學家Benzer 以T4 噬菌體作為研究材料，分析了基因內部的精細結構，提出順反子學說。該學說打破了過去關于基因是突變、重組、決定遺傳性狀的“三位一體” 概念及基因是最小的不可分割的遺傳單位的觀點。Benzer 認為順反子為基因功能不可分割的單位。能產生一種多肽的是一個順反子，順反子也就是基因的同義詞。但一個順反子可以包含一系列突變單位——突變子。突變子是DNA 中構成基因的一個或若干個核苷酸。由于基因內的各個突變子之間有一定距離，所以彼此間能發(fā)生重組，重組頻率與突變子之間的距離成正比，距離近，重組頻率低；距離遠，重組頻率就高。順反子概念把基因具體化為DNA 分子的一段序列，它負責遺傳信息傳遞，是決定一條多肽鏈的完整性的功能單位；但它又是可分的，組成順反子的核苷酸可以獨自發(fā)生突變或重組，而且基因與基因之間還有相互作用。基因排列的位置不同，會產生不同的效應。
1961 年，法國科學家Jacob 和Monod 在研究大腸桿菌乳糖代謝的調節(jié)機制中，發(fā)現(xiàn)有些基因不起蛋白質合成模板的作用，只起調節(jié)或操縱作用，提出了操縱子學說。從此，根據基因功能把基因分為結構基因、調節(jié)基因和操縱基因。
2.基因的現(xiàn)代概念
20 世紀70 年代以后，隨著分子生物學研究的深入，人們能夠在分子水平上認識基因的結構與功能，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了移動基因、斷裂基因、重疊基因及假基因等，對基因的認識有了進一步深化。
（1）移動基因（movable gene）
1951 年，美國遺傳學家McClintock 提出了可移動的遺傳基因學說，即跳躍基因（jumping gene）。該學說認為基因可從染色體的一個位置跳躍到另一個位置，甚至從一條染色體跳躍到另一條染色體上，為研究遺傳信息的表達與調控、生物進化與癌變提供了線索。
（2）斷裂基因（spliting gene）
斷裂基因最初是Roberts 和Sharp 在腺病毒研究中發(fā)現(xiàn)的（圖1-1）。過去人們認為，基因的遺傳密碼子連續(xù)不斷地排列在一起，形成一條沒有間隔的完整的基因實體。事實上，一個基因可分隔成不連續(xù)的若干區(qū)段，我們稱這種編碼序列不連續(xù)的間斷基因為斷裂基因。根據當前的研究，所有哺乳動物、脊椎動物和高等植物以及簡單的真核生物（如酵母），甚至少數原核生物中都存在斷裂基因。
（3）重疊基因（overlapping gene）
傳統(tǒng)的基因概念把基因看成是互不重疊、單個分離的實體。在人們的觀念中，一直認為同一段DNA 序列內不存在重疊的讀碼結構。1973 年，哈佛大學的Weiner 等在研究感染大腸桿菌的Qβ病毒時，發(fā)現(xiàn)有兩個基因在編碼生成蛋白質時是從同一起始點開始的。1977 年， Sanger等測定了噬菌體ΦX174 DNA 全序列的5735 （現(xiàn)為5737 ）個核苷酸，最多能編碼1795 個氨基酸，所合成的全部蛋白質的總相對分子質量最多為197 000 （以每個氨基酸平均相對分子質量為110 計算），可實際測定相對分子質量卻是262 000 。這是因為不同基因的核苷酸序列有時是可以共用的，同一段DNA 能夠編碼兩種甚至三種蛋白質分子（圖1-2），我們稱這樣的兩個基因為重疊基因。
（4）假基因（pseudogene）
1977 年， Jacq 等根據對非洲爪蟾5S rRNA 基因簇的研究，首次提出假基因的概念，該基因的5′端有16bp 的缺失以及另外14bp 的錯配。隨著大量不同家族的假基因的發(fā)現(xiàn)，假基因被明確限定為與功能基因相關的、有缺陷的核苷酸序列。假基因一度由于與正�；虼嬖诮Y構上的差異，或不能轉錄或翻譯，或產生有缺陷的蛋白質而失去原有功能，被認為是“死亡基因” 。隨著對非表達序列的深入研究，假基因的重要性比我們想象的要大，有的對生存至關重要。
隨著生命科學日新月異的發(fā)展，更多新的基因存在形式不斷被發(fā)現(xiàn)，基因的內涵也在不斷發(fā)生變化，我們對基因的理解也在不斷地發(fā)展和深化。但基因的本質仍然是遺傳信息的結構與功能單位，有人用基因就是一套與轉錄相關的順式遺傳指令來概括基因的概念。這類順式遺傳指令可以轉錄，也可以不轉錄；在DNA 結構上可連續(xù)，也可不連續(xù)；轉錄本可以是一種，也可以是幾種（表現(xiàn)在轉錄的起始、終止或剪輯的差異上）；翻譯后的加工也會造成產物的多樣性，強調了基因編碼產物形式的多樣性�；蛴腥绱硕嗟膬群托螒B(tài)，與生命的進化和滿足不同生理活動的需要是分不開的。
二、基因工程的概念
基因工程（gene engineering）是以遺傳學、生物化學和分子生物學等學科為基礎，引入工程學的一些概念，通過周密的實驗設計，進行精確的實驗操作，在體外通過人工“剪切” 和“拼接” 等方法將核酸分子進行改造，然后插入病毒、質�；蚱渌d體分子，構成遺傳物質的新組合，并使之摻入原先不含有該分子的宿主細胞內，而且能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖，高效率地達到預期目的。
基因工程在理論上可自成體系，稱為基因工程學，從方法上又是一門成熟、應用廣泛的實驗技術，正是由于其雙重性，相關術語很繁雜，未很好地統(tǒng)一，在文獻中常見的有遺傳工程（genetic engineering ）、基因工程（gene engineering ）、基因操作（genemanipulation）、重組DNA 技術（recombinant DNA technology ）以及基因克�。╣ene cloning）、分子克�。╩olecular cloning ）等。這些術語所代表的具體內容都是彼此相關的，在許多場合下被混用，很難嚴格區(qū)分。從某種意義上講，它們之間的差別，僅僅是各自考慮的角度和強調的側重點不同。
在英語中“clone （克�。� 一詞當名詞使用時，是指從一個共同祖先經無性繁殖得到的一群遺傳上同一的DNA 分子、細胞或個體所組成的特殊的生命群體；而當“clone” 作動詞使用時，則是指從同一個祖先產生這類同一的DNA 分子群體、細胞群體或個體群體的過程。所以要注意在不同的場合，克隆一詞有不同的含義。在體外重新組合DNA 分子的過程中，是通過能夠獨立自主復制的載體分子質粒或噬菌體為媒介，將外源DNA 引入宿主細胞進行增殖，從而為遺傳上同一的生物品系（它們都帶有同樣的重組DNA 分子）成批地繁殖和生長提供了有效的途徑。故此，習慣上也把基因工程稱為基因克隆或DNA 分子克隆。
在中文文獻中，曾將“DNA cloning” 直接譯為DNA 純系繁殖，實質上它是特指利用微生物制備大量純一的特定DNA 片段的一種方法。由于運用重組DNA 技術能夠按照人們預先的設計創(chuàng)造出許多新的遺傳結合體、具有新奇遺傳性狀的新型生物，因此有時人們又把基因工程籠統(tǒng)地稱為遺傳工程或遺傳操作。其實這種將“遺傳工程” 和“基因工程” 兩個術語不加區(qū)分地使用，甚至認為兩者完全等同的認識是不準確的。嚴格地說，遺傳工程是指以改變生物有機體性狀特征為目標的遺傳信息的操作（the manipulation of the information content ），它既包括常規(guī)的選擇育種，也包括相對復雜的基因克隆等不同的技術層次。因此，遺傳工程雖然包括了基因工程的內容，但它所涉及的內容卻比基因工程要廣泛得多，兩者之間是有差別的。
三、基因工程的操作流程
基因工程的主要步驟為：切— 接— 轉— 選— 表達（圖1-3），具體操作流程如下。
（1）分離或合成基因（isolation or synthesis of gene）
從復雜的生物有機體基因組中，經過酶切消化或PCR 擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA 片段，這種DNA 片段被稱為“目的基因” 。
（2）體外重組（recombination of DNA in v itro）
在體外，將帶有目的基因的外源DNA 片段連接到能夠自我復制并具有選擇標記的載體分子上，形成重組DNA 分子。
（3）外源DNA 導入細胞中（introduction of foreign DNA into cell）
將重組DNA 分子轉移到適當的受體細胞（亦稱宿主細胞），并與之一起增殖。
（4）篩選（selection of recombinant DNA ）
從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得重組DNA 分子的受體細胞克隆。目的基因的導入過程是肉眼看不到的，因此，要知道導入是否成功，應事先找到特定的標志。例如，我們用一種經過改造的抗四環(huán)素質粒pSC100 作載體將一種基因轉入自身無抗性的大腸桿菌時，如果基因轉入后大腸桿菌不能被四環(huán)素殺死，就說明轉入獲得成功。
（5）鑒定（identification and analysis of cloned gene）
從篩選出來的受體細胞克隆中提取出已經得到擴增的目的基因，供進一步分析研究使用。
（6）表達（expression of cloned gene）
將目的基因克隆到表達載體上，導入高效、穩(wěn)定的具有功能性表達能力的基因工程細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產生出所需要的目標產物。
（7）分離表達產物（isolation of product）
利用工程技術大規(guī)模培養(yǎng)上述基因工程細胞，獲得大量的外源基因表達產物并分離、純化，獲得所需的基因工程產品。
上述步驟可歸并為兩大部分，分屬上游技術（步驟1～5 ）和下游技術（步驟6 、7）。上游技術具有一定的共性，下游技術具有較強的個性，兩大部分有機結合成為一個整體。上游技術是基因克隆的核心與基礎，但必須與下游技術密切聯(lián)系才有生命力，所以上游設計中應以簡化下游工藝和裝備為指導思想。下游技術必須依賴上游技術才能不斷開拓、發(fā)展、壯大，下游技術是上游基因克隆藍圖的體現(xiàn)和保證，是克隆基因產業(yè)化的關鍵，兩者必須兼顧。我國在上游技術方面與發(fā)達國家差距較小，下游技術方面差距較大。加強下游技術的創(chuàng)新研究是今后努力的方向。
四、人類基因組計劃
1.人類基因組計劃（human genome project ， HGP）
對基因組核苷酸全序列的測定與分析，是重組DNA 技術促進基礎生物學研究的出色范例。英國分子生物學家Sanger 領導的研究小組，于1977 年首先完成了全長5387bp 的ΦX174 噬菌體基因組全序列測定工作，揭開了大規(guī)�；蚪M測序工作的序幕。日本科學家先后于1987 年完成了全長155 844bp 的煙草葉綠體基因組全序列的測定， 1988 年完成了全長121 024bp 的地錢葉綠體基因組全序列的測定， 1989 年又完成了全長134 525bp 的水稻葉綠體基因組全序列的測定。然而這些細胞器的基因組無論在大小還是在復雜性方面，都是無法同人類基因組相比擬的。
1985 年，美國科學家首先提出了研究人類基因組的設想。在經過長達4 年的調查和論證的基礎上， 1988 年，美國國會批準了人類基因組作圖和測序計劃。同年9 月，DNA 雙螺旋結構發(fā)現(xiàn)者之一Watson 在眾望所歸之下，接受了美國衛(wèi)生研究院的邀請，出任人類基因組計劃的負責人，開始了令全世界矚目的基因組研究。該計劃旨在闡明人類基因組30 億個堿基對的序列，發(fā)現(xiàn)所有的人類基因，并明確其在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認識自我。該項被新聞界喻為“基因圣戰(zhàn)” 的、規(guī)模空前的科研計劃總投資達30 億美元。
由于人類基因組計劃具有的重要意義和深遠影響，其一經提出，便立即引起許多國家科技界與政府機構的高度重視和強烈反響。特別是西歐和日本等一些經濟發(fā)達的國家，紛紛表示要獨立開展或參與國際合作研究。著名的遺傳學家談家楨教授等人也積極倡議中國迅速參與人類基因組的國際合作研究。美國于1990 年正式啟動人類基因組計劃后，德國、日本、英國、法國、中國5 個國家的科學家先后正式加入，中國的人類基因組計劃是于1994 年初在吳旻院士、強伯勤院士、陳竺院士和楊煥明教授的倡導下啟動的， 1999 年9 月正式加入該計劃，承擔了1% 的人類基因組（約3000 萬bp）的測序任務，是參與該計劃唯一的發(fā)展中國家。有科學家認為，人類基因組計劃是與曼哈頓原子計劃、阿波羅登月計劃并列的人類科學史上的重大工程，是一項改變世界、影響到每一個人的科學計劃。
人類基因組計劃的科學宗旨與“定時、定量、定質” 的具體目標，是測定組成人類基因組的上億個核苷酸的序列，從而闡明人類基因組及所有基因的結構與功能、解讀人類的全部遺傳信息、揭開人體奧秘的基礎，將把人類帶入基因醫(yī)學的新時代。生命物質的一致性與生物進化的連續(xù)性以及人類基因組計劃所建立的策略與技術的通用性，意味著人類基因組計劃可以奠定揭開生命最終奧秘的基礎，由此帶動生物信息學等一批相關學科的形成和發(fā)展，促進學科交叉與重組，其帶來的潛在經濟效益也是驚人的。
2003 年4 月，美國人類基因組研究項目首席科學家Collins 博士在華盛頓隆重宣布，美國、英國、日本、法國、德國和中國科學家經過13 年努力共同繪制完成了人類基因組序列圖，人類基因組計劃的所有目標全部實現(xiàn)，標志人類基因組計劃勝利完成。
2.基因組學（genomics）
1920 年，德國漢堡大學教授Hans Winkler 首次使用基因組（genome）這一名詞。一個生物體的基因組是指整套染色體所含有的完整的DNA 序列，包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA 序列�；蚪M一詞可以特指整套核DNA （如核基因組），也可以特指細胞器基因組，如線粒體基因組或葉綠體基因組。所有生命都具有指令其生長與發(fā)育、維持其結構與功能所必需的遺傳信息，現(xiàn)在認為，基因組包含生物所具有的攜帶遺傳信息的遺傳物質的總和。

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