分子生物學(xué)基本技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)
《分子生物學(xué)基本技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》共24個(gè)實(shí)驗(yàn),分別介紹了組織或細(xì)胞總RNA制備和反轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈反應(yīng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、質(zhì)粒重組與鑒定、淋巴細(xì)胞的分離等基因克隆技術(shù),以及將所克隆基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的蛋白質(zhì)表達(dá)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞功能的檢測等目前在生物醫(yī)學(xué)研究中比較常用的實(shí)驗(yàn)方法。
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《分子生物學(xué)基本技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》主要供本科高年級(jí)及研究生學(xué)習(xí)使用,以強(qiáng)調(diào)分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用性,同時(shí)也可作為青年科技工作者進(jìn)行科研工作的參考書。
實(shí)驗(yàn)一組織或細(xì)胞總RNA制備和反轉(zhuǎn)錄
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1.掌握制備細(xì)胞或組織總RNA的原理和方法。
2.掌握RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的原理和方法。
二、實(shí)驗(yàn)原理
總RNA提取試劑盒可從各種細(xì)胞或組織中快速提取總RNA,可同時(shí)處理大量不同樣品。裂解液中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚,其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞,促使核蛋白體解離,使RNA與蛋白質(zhì)分離,并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí),它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相,離心后可形成水相層、中間層和有機(jī)層(下層),這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA,有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。整個(gè)操作可在1h內(nèi)完成,提取的總RNA沒有DNA和蛋白質(zhì)的污染,可用于Northernblot、Dotblot、polyA篩選、體外翻譯、RNase保護(hù)分析和分子克隆。
三、材料、試劑與儀器
1.材料
2.試劑
新鮮全血。
總RNA提取試劑盒(表1-1)、氯仿、RNA-freeddH2O、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(表1-2)。
表1-1總RNA提取試劑盒內(nèi)容
2分子生物學(xué)基本技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)
續(xù)表
表1-4反轉(zhuǎn)錄引物的選擇
圖1-1陽性對(duì)照簡圖
3.儀器
低溫臺(tái)式高速離心機(jī)、低溫冰箱、紫外檢測儀、電泳儀、電泳槽、微量移液器、微量移液器吸頭等。
4分子生物學(xué)基本技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)
四、實(shí)驗(yàn)步驟
。ㄒ唬┛俁NA提取
**次使用前應(yīng)在去蛋白液RD、漂洗液RW中加入無水乙醇,加入量請(qǐng)參見瓶上標(biāo)簽。
。1)樣品處理如下。
1)組織:將組織在液氮中磨碎。每50~100mg組織加1ml裂解液RZ,用刀漿儀進(jìn)行刀漿處理。樣品體積應(yīng)不超過裂解液RZ體積的1/10。
2)單層培養(yǎng)細(xì)胞:直接在培養(yǎng)板中加入裂解液RZ裂解細(xì)胞,每10cm2面積加1ml裂解液RZ。用移液器吹打幾次。
注意:裂解液RZ的加入量根據(jù)培養(yǎng)瓶面積決定,不是由細(xì)胞數(shù)決定。如果加入量不足,可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染。
3)細(xì)胞懸液:離心取細(xì)胞,棄上清。每5×106~10×106動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞加入1ml裂解液RZ。加裂解液RZ前不要洗滌細(xì)胞,以免降解mRNA。
4)血液:直接取新鮮血液,加入3倍體積的裂解液RZ(推薦0.25ml血液+0.75ml裂解液RZ),充分振蕩混刀。
。2)將刀漿樣品在15~30℃放置5min,使得核蛋白體完全分離。
(3)可選步驟:4℃,12000r/min離心5min,取上清,轉(zhuǎn)入一個(gè)新的無RNase的離心管中。
注意:如果樣品中含有較多蛋白質(zhì)、脂肪、多糖或肌肉、植物結(jié)節(jié)部分等,可加此步驟離心去除。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜、多糖、高分子量DNA,RNA存在于上清溶液中。
。4)加入200μl氯仿,蓋好管蓋,劇烈振蕩15s,室溫放置3min。
(5)4℃,12000r/min離心10min,樣品會(huì)分成3層:黃色的有機(jī)相,中間層和無色的水相,RNA主要在水相中,水相的體積約為所用裂解液RZ的50%。把水相轉(zhuǎn)移到新管中,進(jìn)行下一步操作。
。6)緩慢加入0.5倍體積無水乙醇,混刀(此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀)。將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中,4℃,12000r/min離心30s,若一次不能將全部溶液和混合物加入吸附柱CR3,可分兩次轉(zhuǎn)入,再4℃,12000r/min離心30s,棄掉收集管中的廢液。
。7)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇),4℃,12000r/min離心30s,棄廢液。
。8)向吸附柱CR3中加入700μl漂洗液RW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙
醇),室溫靜置2min,4℃,12000r/min離心30s,棄廢液。
。9)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW,室溫靜置2min,4℃,12000r/min離心30s,去除殘余液體。
。10)將吸附柱放入2ml收集管中,4℃,12000r/min離心2min,去除殘余液體
。ㄗ⒁猓捍瞬襟E目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,離心后將吸附柱CR3在室溫放置片刻,或置于超凈工作臺(tái)上通風(fēng)片刻,以充分晾干。如果有漂洗液殘留,可能會(huì)影響后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄等實(shí)驗(yàn)操作)。
。11)將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中,加30~100μlRNase-freeddH2O,室溫放置2min,4℃,12000r/min離心2min。洗脫緩沖液體積應(yīng)不少于30μl,體積過小影響回收效率。且RNA應(yīng)保存在.70℃,以防降解。
注意:如果想提高RNA得率,可重復(fù)上步操作一次,合并兩次得到的溶液。
。ǘ┓崔D(zhuǎn)錄
合成的cDNA引物可結(jié)合實(shí)際情況從OligodT-AdaptorPrimer、Random9mers或特異性下游引物中任選一種。
。1)按表1-5配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。
。2)按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
使用Random9mers進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí),首先在30℃下保溫10min,使Random9mers延伸達(dá)到足夠長度,以便在42~55℃退火時(shí)與模板RNA充分結(jié)合。
五、RNA質(zhì)量的判斷
。ㄒ唬┩暾耘袛
通常使用瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA的完整性。理論上,完整的RNA擁有28S∶18S=2.6∶1左右的比例(即相對(duì)分子質(zhì)量之比)。由于大分子rRNA的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)程度更高。較小分子的rRNA更容易降解,再加上RNA電泳受許多因素影響,包括電泳條件、上樣量、被EB飽和的程度等,因此準(zhǔn)確評(píng)估28S∶18S并不容易。另外,來自不同器官組織,在確定其mRNA沒有降解的前提下,其比例也有區(qū)別(如肝和肺的比例較低)。可以說,2∶1是高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn),但低于2∶1并不就是質(zhì)量低。一般的,如果28S和18S條帶清晰,且28S∶18S>1,該完整性就可以滿足絕大部分后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖1-2所示。
圖1-21%瓊脂糖RNA電泳圖1~3.RNA樣品,28S∶18S=2.6∶1
(二)純度的判斷
260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分別代表了核酸、背景(溶液渾
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