分子生物學實驗——實用操作技術(shù)與應(yīng)用案例
《分子生物學實驗：實用操作技術(shù)與應(yīng)用案例》共分為兩部分。上篇重點介紹分子生物學常用實驗技術(shù)，包括總RNA的提取和cDNA的合成、基因組DNA的制備和PCR反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳和目的DNA片段回收、DNA的濃縮與目的片段的連接、細菌感受態(tài)細胞的制備與質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒DNA的提取和酶切、組織總蛋白提取、聚丙烯酰胺凝膠電泳和Westernblot分析、重組蛋白的表達和純化、蛋白互作分析、農(nóng)桿菌介導植物的遺傳轉(zhuǎn)化、抑制消減雜交、eDNA芯片雜交、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)、凝膠阻滯分析等技術(shù)的原理及操作步驟。這些技術(shù)的來龍去脈及發(fā)展趨勢在目前已經(jīng)出版的很多書籍和綜述中都有詳細的介紹，因此《分子生物學實驗：實用操作技術(shù)與應(yīng)用案例》對這些內(nèi)容只是作簡明扼要的說明。下篇用了很大的篇幅介紹這些實驗技術(shù)的應(yīng)用實例，通過對這些具體應(yīng)用實例的閱讀和了解，使得剛開始接觸和需要應(yīng)用分子生物技術(shù)的學生或研究人員能很容易地理解這些實驗技術(shù)的操作方法及應(yīng)用過程中各環(huán)節(jié)的要求，并使其盡快入門，學會應(yīng)用這些實驗技術(shù)設(shè)計自己的實驗方案。
《分子生物學實驗：實用操作技術(shù)與應(yīng)用案例》可作為從事生物學、醫(yī)學、農(nóng)學、環(huán)境生物學領(lǐng)域研究的學生及教學人員的參考用書。
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當前所有生命現(xiàn)象的研究都已深入到分子水平，分子生物學技術(shù)的應(yīng)用也滲透到生物學相關(guān)學科的所有研究領(lǐng)域，并成為重要的研究方法和手段，這種形勢要求生物學所有專業(yè)的本科生和研究生都要了解現(xiàn)代分子生物學的基礎(chǔ)理論知識，掌握并學會應(yīng)用分子生物學的實驗技術(shù)及方法。將現(xiàn)代分子生物學設(shè)置為研究生的必修課，使他們能夠掌握遺傳信息的傳遞和表達機制，學會運用基本的實驗技術(shù)對遺傳物質(zhì)進行實驗操作，對于培養(yǎng)和訓練他們的研究性思維大有益處。在給研究生開課的過程中，我們發(fā)現(xiàn)新進研究生由于缺乏實際應(yīng)用分子生物學實驗操作的經(jīng)驗和體會，因此很難理解和掌握現(xiàn)有課本上描述的各類分子生物學實驗技術(shù)。為了提高研究生掌握和應(yīng)用分子生物學實驗操作技術(shù)的能力，并加強其對這些實驗技術(shù)的應(yīng)用體驗，我們根據(jù)自己的研究經(jīng)驗及積累的實驗操作方法和技術(shù)技巧編寫了本書。本書系統(tǒng)匯總了目前分子生物學中較為實用的一些實驗操作技術(shù)及應(yīng)用實例，涉及的內(nèi)容包括PCR產(chǎn)物的亞克隆技術(shù)及應(yīng)用實例、原核表達載體的構(gòu)建與應(yīng)用實例、酵母細胞表達載體的構(gòu)建與應(yīng)用實例、利用通路克隆技術(shù)構(gòu)建植物表達載體及應(yīng)用實例、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化技術(shù)、酵母感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化技術(shù)、常用轉(zhuǎn)基因植物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)、基因插入情況與拷貝數(shù)的檢測技術(shù)、基因表達水平的檢測技術(shù)、差異表達基因的分離鑒定技術(shù)、轉(zhuǎn)基因株系表型分析技術(shù)、蛋白質(zhì)互作分析技術(shù)、轉(zhuǎn)錄因子的功能分析技術(shù)等。這些技術(shù)經(jīng)過我們往屆研究生的體驗和反復(fù)應(yīng)用及驗證，確認為可操作性與實用性較強的技術(shù)。
本書可作為生物學、農(nóng)學、醫(yī)學、環(huán)境生物學專業(yè)的博士和碩士研究生及這些專業(yè)高年級本科生的參考用書，也可以作為新進研究生的實驗培訓教材和實驗操作指南，使讀者能及時掌握分子生物學實驗操作技術(shù)。
目錄
前言
上篇 實驗操作技術(shù)
第一章 核酸分析與分子克隆技術(shù) 3
一、用PCR擴增目的DNA片段 3
二、瓊脂糖凝膠電泳 9
三、DNA片段的回收 10
四、用乙醇沉淀法濃縮DNA 樣品 11
五、目的DNA片段的連接 11
六、感受態(tài)細胞的制備 13
七、質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化 15
八、質(zhì)粒DNA的提取 18
九、質(zhì)粒的酶切 20
十、利用Gateway技術(shù)構(gòu)建植物表達載體 21
十一、Southern雜交分析 21
第二章 蛋白質(zhì)分析技術(shù) 23
一、植物組織總蛋白提取及含量的測定 23
二、聚丙烯酰胺凝膠電泳 24
三、Western blotting分析 26
四、Far Western blotting分析 28
五、重組蛋白的表達和純化技術(shù) 29
六、蛋白兔抗的制備 31
七、蛋白互作分析實驗技術(shù) 32
第三章 農(nóng)桿菌介導的植物轉(zhuǎn)基因操作技術(shù) 35
一、原理 35
二、實驗操作流程 35
第四章 基因差異表達分析技術(shù) 40
一、抑制消減雜交 40
二、cDNA芯片雜交 48
第五章 DNA與蛋白互作分析技術(shù) 49
一、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù) 49
二、凝膠阻滯分析技術(shù) 51
下篇 應(yīng)用案例
第六章 通路克隆技術(shù)入門載體的改造 57
一、含有Rubisco小亞基啟動子和葉綠體基質(zhì)定位序列的通路克隆入門載體的構(gòu)建 57
二、通路克隆入門載體pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*的構(gòu)建 63
三、通路克隆入門載體pENTR*-T-GFP的構(gòu)建及功能驗證 68
第七章 用Gateway技術(shù)構(gòu)建目的基因的光誘導型植物表達載體 75
一、光誘導型GFP基因植物表達載體的構(gòu)建 75
二、光誘導型GUS基因植物表達載體的構(gòu)建 76
三、光誘導型hps/phi融合基因植物表達載體的構(gòu)建 80
四、擬南芥細胞質(zhì)型蘋果酸脫氫酶基因AMDH 光誘導型植物表達載體的構(gòu)建 84
第八章 用Gateway技術(shù)構(gòu)建目的基因的組成型植物表達載體 89
一、GFP基因植物組成型表達載體的構(gòu)建 89
二、短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因植物表達載體的構(gòu)建 91
三、大豆14-3-3a基因(SGF14a)植物表達載體的構(gòu)建 96
第九章 用Gateway 技術(shù)構(gòu)建目的基因與報告基因融合植物表達載體 100
一、大豆轉(zhuǎn)錄因子GmbHLH30與GF 融合基因植物表達載體的構(gòu)建 100
二、擬南芥RCA啟動子和熒光素酶基因LUC 融合表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用 104
第十章 用Gateway技術(shù)構(gòu)建目的基因的RNAi干擾植物表達載體 113
蠶豆PP1c基因抑制表達載體的構(gòu)建與應(yīng)用 113
第十一章 用Gateway技術(shù)構(gòu)建串聯(lián)兩個目的基因表達盒的植物表達載體 118
二羥基丙酮合成酶和二羥基丙酮激酶基因表達盒串聯(lián)的植物表達載體構(gòu)建 118
第十二章 用經(jīng)典的酶切連接技術(shù)構(gòu)建目的基因的植物表達載體 128
一、檸檬酸合成酶基因cs光誘導型植物表達載體pPZP211-PrbcS-cs的構(gòu)建 128
二、芹菜絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的植物表達載體構(gòu)建 132
第十三章 利用植物表達載體轉(zhuǎn)化植物及轉(zhuǎn)基因植物表型分析 136
一、用GFP 和GUS 植物表達載體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物及轉(zhuǎn)基因的整合與表達分析 136
二、用植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi轉(zhuǎn)化天竺葵獲得轉(zhuǎn)基因植株及表型分析 141
三、用植物表達載體pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS轉(zhuǎn)化擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因植株及表型分析 145
四、用植物表達載體pPZP211-PrbcS-cs轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株及表型分析 156
五、用植物表達載體p1300-Surperpromoter-AgSAT轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因植株表型分析 160
六、利用CS和PEPC的表達載體產(chǎn)生雙轉(zhuǎn)基因煙草及表型分析 163
第十四章 原核表達載體的構(gòu)建和應(yīng)用 170
一、惡臭假單胞菌谷胱甘肽-非依賴型甲醛脫氫酶的原核表達載體的構(gòu)建和應(yīng)用 170
二、黑大豆醛脫氫酶基因原核表達載體的構(gòu)建和應(yīng)用 175
第十五章 酵母表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用 181
AtHSFA1d基因在酵母中的表達與功能分析 181
第十六章 利用SSH-cDNA文庫技術(shù)分析基因的差異表達 185
一、噴施甲醇的蠶豆葉片中上調(diào)表達基因的分離與鑒定 185
二、甲醛脅迫擬南芥葉片中下調(diào)表達基因的分離與鑒定 188
第十七章 利用DNA芯片技術(shù)分析基因的差異表達 191
一、用擬南芥全基因組芯片雜交分析基因的差異表達 191
二、用大豆全基因組芯片雜交分析基因的差異表達 194
第十八章 利用免疫共沉淀技術(shù)分析體內(nèi)蛋白與蛋白之間的的相互作用 199
一、用免疫共沉淀分析鋁脅迫下大豆根中14-3-3蛋白對質(zhì)膜H+-ATPase 活性的調(diào)控 199
二、用免疫共沉淀分析煙草質(zhì)膜H+-ATPase與14-3-3蛋白的互作對干旱脅迫的應(yīng)答 203
三、用免疫共沉淀分析云南紅梨果皮轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH 和WD40的互作模式 207
第十九章 利用雙分子熒光技術(shù)分析植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用 209
在洋蔥表皮細胞中驗證PyMYB、PybHLH 和PyWD40之間的相互模式 209
第二十章 用Pulldown 和Far Western blot技術(shù)做體外實驗分析蛋白質(zhì)之間的互作 213
PyMYB、PybHLH和PyWD40重組蛋白之間互作模式分析 213
第二十一章 用ChIP分析植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子和啟動子的結(jié)合 218
一、云南紅梨果皮MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合花青素結(jié)構(gòu)基因啟動子元件的分析 218
二、甲醇和乙醇刺激對煙草轉(zhuǎn)錄因子RSG與GA20ox1啟動子結(jié)合的影響 224
第二十二章 利用EMSA技術(shù)做體外實驗分析轉(zhuǎn)錄因子和基因啟動子元件的結(jié)合 229
EMSA分析在體外PyMYB與花青素合成結(jié)構(gòu)基因啟動子的結(jié)合 229
第二十三章 利用PCR技術(shù)篩選擬南芥的T-DNA插入突變體 231
一、擬南芥SHMT1純合T-DNA插入突變體的篩選 231
二、擬南芥HY5純合T-DNA插入突變體的篩選 232
三、擬南芥bHLH30純合T-DNA插入突變體的篩選 234
參考文獻 237
附錄 240
一、常用抗生素貯存液配制方法 240
二、常用培養(yǎng)基的配制 241
三、常用菌種的特性 244
四、常用質(zhì)粒載體圖譜 246
五、轉(zhuǎn)基因生物表型常見生理生化指標的分析方法 264
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